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Western Blot內參選擇

發表時間:2017-03-25 22:30

  要檢測一個基因的表達產物是否正,或者比達產物量的相對變化,首方法是Western Blot。因Western Blot操作相對簡單方便,既可以定性分析表達產物,同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。    

       然,利的候Western Blot做起來很簡單,可不候也很令人心――做不出、假果出多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦??竟,作有活性的生物大分子,抗體和抗原的反不象1+1那,而用這種定的試劑定同知之甚少的表達產物,確實是有一定的不定性的。所以,嚴謹的 Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系,對實驗結果分析是非常有用。特是當實驗現問題時,借助參照體系很容易就可以問題所在,而不必抓耳腮怨天尤人。    

       良好的參照體系通常包括分子量Marker(用來定蛋白條帶對應的分子量大小)、空白照(如果是誘導體系還應該誘導前的照)、已知量物的正照,有內參。可是由于經費限制或者偷懶的原因,國內的不少人做Western Blot往往省略參照,果出現問題時無法分析果,即便有果也可能影響結果的分析。  

       內參即是內部參照(Internal Control),于哺乳胞表一般是指由管家基因編碼的蛋白(Housekeeping Proteins),它在各組織胞中的表恒定,在檢測蛋白的表水平常用它來做參照物。在WesternBlotting 實驗中,除了需要行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、膜、蛋白抗體孵育、色等步驟以外,需要行內參的檢測,以校正蛋白定量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結果的準性。  

       實際上內參是最容易被忽略的一。我知道,要用Western Blot 比不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表量的相多少,前提條件是等量的胞上,才有比的基,特量不高,上量的差就很可能影響結果的分析,所以需要內參。在國外表的文章中,Western Blotting 實驗結須進行內參校正已成種慣例。但是,國內仍有不少科研人在Western Blotting實驗中忽略了內參的使用,將蛋白定作為規范需相互比的各種樣量等同的唯一方法。  

       然而各蛋白質濃度定量方法,都存在局限性,不能完全準定各種樣品的蛋白度。如UV法直接定量,測試較純凈、成分相對單一的蛋白,相于比色法來,操作簡單,但是容易受到平行物如DNA的干,且敏感度低,要求蛋白的高。比色法定蛋白度一般有BCA、Bradford、 Lowry 等幾方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白以及去污劑的干。Bradford法敏感度最高,且與一系列干Lowry、BCA 反(如DTT,基乙醇)相容,但是污劑依然是敏感的,其最主要的缺點是不同的準品會致同一品的果差異較大,無可比性。外,蛋白定量以后需要等量上,此步驟也存在操作差。在Western blotting實驗時使用內參,即可便地定量和上樣步驟產生的行校正。    

       在Western Blotting中使用內參其就是在WB程中外用內參對應的抗體檢測內參,這樣檢測目的物的同可以檢測內參的表,由于內參在各組織胞中的表恒定,借助檢測每品內參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的果才更可信。此外使用內參可以作空白照,檢測蛋白膜情況是否完全、整個Western Blot色或者光體系是否正常。    

       在Western Blotting實驗過程中使用內參的方法通常有以下三。    

       第一是超級簡便的標記內參使用法,只要在二抗孵育加入HRP標記內參抗體,按照正常操作即可;    

       第二是普通內參,當目的蛋白的分子量大小與用的內參蛋白分子量相差不大,可以先行目的蛋白的抗體溫育色和檢測,然后使用Strip沖液洗掉膜上的抗體,重新行內參蛋白的抗體溫育、檢測。    

       第三,當目的蛋白的分子量大小與用的內參蛋白分子量大小相差比情況下,可以在膜后染,根據蛋白Marker的大小將膜剪大分子量和小分子量部分,使內參蛋白與目的蛋白分,然后兩塊膜分與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體行溫育,二抗溫育以及色。    

       常用的蛋白內參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我們選擇內參與要檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇的內參!    

       actin即肌蛋白,是胞的一重要骨架蛋白。actin大致可分,其中四是不同肌肉組織性的,包括alpha-skeletalmuscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smoothmuscle actin,其余兩種廣泛分布于各種組織中,包括beta-actin(β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。些不同的組織分布是不一的,在肌肉組織中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參,不能一概而的。beta-actin作內參是得到了公的,針對大多數組織胞來的,它廣泛分布于漿內,表量非常富。盡管最近有一些文章已經開疑beta-actin作內參的有效性(好像是于上量>20ug的蛋白區分能力下降,不清楚了),但是文章應該還是沒有問題的。至于其他的內參也是可以考用的,GAPDH(甘油-3-酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關鍵酶,而tubulin和actin似,是胞骨架的成部分,但是不是肌肉的主要成分,應該是一個代替品。三時發化的情況很少,需要具體分析。一旦出上述三內參同時發化,如果是蛋白可以用胞核的內參如PCNA,TATA-box bingding protein(TBP)甚至粒體的內參來代替,當然一般這種可能性出的幾率微乎其微。    

       不同異構體表達對蛋白的檢測是有很大的影抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白,很多抗體不出條未必是抗體量的問題。很多公司的內參抗體是用抗原片段制的,不同的公司選擇的片段不一。以最常用的beta-actin例,有的公司選擇N-端,有的選擇C-端。用N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作抗原制抗體(抗和多抗)的占大多數,主要有santacruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat# A1978等),ProSci(Cat#3779),Cell Signaling(Cat#4967),AxxoraPLATFORM(BET-A300)等,這類抗體均不能檢測心肌和橫肌中的actin條用C-端16aa短抗原制抗體的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等),這類抗體可以在肌肉胞中檢測到actin性信號。有候在實驗檢測內參時產生“組織性”,就是由于抗體選擇造成的。  

       actin種異構體存在組織分布特性,不同型actin之具有高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌胞中的一骨架蛋白,選擇作β-actin內參首先得保組織廣泛表的(尤其是做蛋白的組織達譜時)。那β-actin抗體的抗原應該用與actin其它異構體一致的基酸序列。公司制抗體是用beta-actin的某一段小短免疫原,可能會因為選取的短在不同型actin之保守與否,而致所制抗體具有一定的組織性.如取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就檢測非肌胞中的actin,而取的短在六型中均存在,此抗體除非肌胞外,可以檢測cardiac,skeletal,smoothmuscle胞的actin。


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